Western blotting ECL化學發光法檢測試劑盒

產品簡介：

SDS-PAGE電泳后，蛋白質按照分子量大小分離，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）后，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶標記的第二抗體起反應，加入發光底物后，能讓膠片感光。經顯影和定影后，可以在膠片上顯示出條帶（抗原所在位置）。

操作步驟：(僅供參考)

常規電泳轉膜后:

1) 清洗轉印膜：將膜剝離下后，作好標記，一般在左上角剪一缺口。室溫用TBS-T 漂洗3 次每次5min,以盡量洗去轉印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結合。

2) 按5g 封閉試劑加100ml 雙蒸水計，配制膜封閉液，配好的膜封閉液為乳白色懸液，將漂洗過的轉印膜放入封閉液內，置搖床孵育，室溫封閉30min。用TBS-T 緩沖液（PH7.6）洗膜，室溫漂洗3 次每次5min。

3) 將10×抗體稀釋液用雙蒸水稀釋成1×（10ml 10×抗體稀釋液加入90ml 雙蒸水，混勻，可4℃保存三個月）。此稀釋液可作為一抗和二抗的稀釋液。

4) 用1×的抗體稀釋液稀釋一抗。根據用量以及一抗的推薦稀釋濃度來稀釋一抗。將雜交膜放入雜交袋中，加入一抗工作液，封口，4℃孵育過夜或37℃搖動孵育2h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步將膜沿電泳方向剪成條，分別作好標記，分開孵育。

5) 用TBS-T 緩沖液（PH7.6）洗膜，室溫漂洗3 次每次5min。

6) 用1×的抗體稀釋液稀釋二抗。根據用量，按10ml 抗體稀釋液加入15ul HRP 標記二抗的比例，配制二抗工作液。將雜交膜放入雜交袋中，加入二抗工作液，封口， 37℃搖動孵育1h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。

7) 用TBS-T 緩沖液（PH7.6）洗膜，室溫漂洗3 次每次10min。

8) 根據用量，取ECL 發光液A、B 等量混勻，加在膜正面，暗室顯色1-5 分種。傾去顯色液，小心用紙吸去顯色液，在上面蓋一層平整的透明紙。再取出感光膠片，做好標記，輕輕的放在膜上，顯色30 秒到1 分鐘，取出膠片浸入顯影液中，觀察顯色情況，再放入定影液中1 分鐘。根據條帶強弱，再次感光時可減短或者加長感光時間（從5 秒到30 分鐘）以期達到理想結果。

注意事項：

1. 請根據一抗來源選擇試劑盒。

2. 可以根據顯色結果來優化實驗反應時間。如背景過深，可延長膜封閉時間，加長最終漂洗次數與時間。如果條帶過弱，可增加抗體濃度，可延長抗體孵育時間或加長感光時間。

3. TBS-T（0.01M，PH7.6）配制方法：稱取NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用800ml 的雙蒸水溶解，用鹽酸調PH 到7.6，再加入0.5ml Tween－20，用雙蒸水 加至1000ml，混勻即可。（也可按照自己的配制習慣來配制）