支原體試劑盒使用注意事項


本試劑盒是利用熒光染料（bisbenzimide,Hoechst 33258）檢測支原體污染。這種染料會結合到DNA的A-T富集區域，因為支原體的DNA中A-T含量高（55％～80％），所以可將其染色而被檢測到。被支原體污染的細胞經染色后在細胞周圍可看到許多大小均的熒光小點，即為支原體的DNA染色斑，說明有支原體污染。Hoechst 33258的大激發波長為346nm，大發射波長為460nm；Hoechst 33258和雙鏈DNA結合后，大激發波長為352nm，大發射波長為461nm。

操作步驟：

貼壁細胞：

1.被檢細胞接種于無菌的6孔細胞培養板中，接種密度為1-2×104。同時，接種正常無支原體感染的同種細胞，作為陰性對照。

2.5天后，先吸去培養液，再加入1ml的固定液，靜置20min，

3.吸去固定液，晾干。

4.于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液（Hoechst 33258工作液須覆蓋全部被檢細胞），37℃避光放置15-20min或室溫靜置20～30min。

5.吸去Hoechst 33258工作液，加入2ml滅菌超純水洗滌三次，直接風干。風干后加入滴封片液，并以蓋玻片覆蓋。

6.熒光顯微鏡觀察。用紫外激發光激發，觀察細胞周圍是否有藍色熒光小點或串珠狀熒光小點。

懸浮細胞：

1.收集需檢測的細胞，1500rpm，5min。

2.將收集的細胞涂片于載玻片上，再加1ml的固定液，靜置20min。

3.吸去固定液，晾干。

4.于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液（Hoechst 33258工作液須覆蓋全部被檢細胞），37℃避光放置15～20min或室溫靜置20～30min。

5.吸去Hoechst 33258工作液，用無菌水洗滌玻片3次，直接風干。風干后加入滴封固液，并以蓋玻片覆蓋。

6.熒光顯微鏡觀察。用紫外激發光激發，觀察細胞周圍是否有藍色熒光小點或串珠狀熒光小點。

注意事項：

1.Hoechst工作液對人體有害，請注意防護。

2.固定液有刺激性氣味，建議在通風櫥進行固定。

3.支原體檢測時，好用不含抗生素的培養液培養2～3代，這樣容易避免假陰性結果。

4.本試劑盒用于6孔板檢測時，可以進行50次檢測反應。

5.檢測支原體污染，可以使用支原體高效Vero細胞，這樣可以提高檢測靈敏度，即將被檢測樣品接種于Vero細胞進行檢測。