有關微生物的代謝說明

一、微生物的生長曲線及其應用

微生物群體生長是指細胞數量的增加，是細胞生長和繁殖的結果?，F以單細胞的分裂方式進行繁殖的細菌為對象考察其群體生長的規律。

將少量細菌接種到一恒定容積的新鮮液體培養基中，在適宜的溫度下進行培養時，它的生長具有一定的規律性。在其生長過程中，定時取樣計算細菌細胞數量。然后以細菌細胞數的對數作縱坐標，以生長時間作橫坐標，繪制所得的曲線叫生長曲線。生長曲線代表了細菌在新的適宜的環境中生長繁殖至衰老死亡過程的動態變化。我們根據細菌生長繁殖速率的不同，將細菌的生長曲線大致分為下列四個時期。

1、延遲期：當少量細菌接種到新鮮的液體培養基后，一般不立即進行繁殖，生長速率等于零，這段時間稱為延遲期。處于延遲期的細菌細胞分裂遲緩、代謝活躍，細胞體積增長較快，但對不良的環境因素如高溫、低溫和高濃度的鹽溶液等比較敏感，容易死亡。

延遲期時間的長短，因細菌種類和培養條件從幾分鐘到幾小時不等，若用生命活動旺盛的細菌接種，且接種量大，則延遲期時間短。

2、穩定期：在這一時期，活細胞數目達到zui高峰，但它的總數不會在增加。這是因為必要的營養物質逐漸耗盡，同時某些有毒代謝產物在積累，以及其他外界因素都會使生長受到抑制，死亡率和繁殖率兩者達到平衡，活菌數保持相對穩定，在曲線上保持平穩。如果為了大量獲得菌體，就應在此階段收獲。這一時期也是發酵過程積累代謝產物的主要階段。以上可以看出，穩定期的微生物，在數量上達到了zui高水平，產物的積累也得到了zui高峰。穩定期的長短與菌種和外界環境條件有關，生產上常常通過補料、調節PH值、調整溫度等措施來延長穩定期，以積累更多的代謝產物。

3、對數期：在此期間，代謝活動zui強，組成新細胞物質zui快，所有分裂形成的新細胞都生活旺盛。這一階段細菌數以幾何級數增加，所以稱為對數期。由于處于對數期的微生物的個體形態、化學組成和生理特性等均較一致，代謝旺盛、生長迅速，所以是研究基本代謝的良好材料，也是發酵工業良好的種子。如果用作菌種，則延遲期很短，以至檢查不出延遲期?？稍诙虝r間內獲得大量微生物以縮短發酵周期。

4、衰亡期：穩定期后如再繼續培養，細菌死亡率逐漸增加，以致死亡率大大超過新生菌，菌體中活菌數急劇下降，出現了“負生長”。此時期為衰亡期

二、測定微生物群體數目的方法

1、計算器測定法：用特制的細菌計數器或血球計算器進行計數。本方法很簡便，可以立即得出結果，但也有一些局限性，主要表現在活細胞不易區分。

2、平板菌落計數法：取一定容量的菌懸液，作一系列的倍比稀釋然后將定量的稀釋液進行平板培養，根據培養出的菌落數，算出培養物中的活菌數，故此法又稱為活菌測定法。

3、稀釋法;將待測樣品作一系列稀釋，如10－1、10－2、10－3等，取1ml接種到新鮮培養基中，然后根據生長的稀釋度與出現生長的zui高稀釋度（即臨界級數），再用“或然率”理論，就可計算出樣品單位體積中細菌的近似值。

4、涂片染色法：將已知體積的待測微生物均勻的涂布在載波片的已知面積內，經固定染色后，在顯微鏡下借助目鏡測微尺測得視野的半徑和面積。得知其中視野菌的總數。然后從幾個視野的平均細胞數計算每毫升原液菌的細菌數。該法適用于細菌，酵母菌和霉菌的孢子全菌數量的測定，故常稱為全菌測定法。

5、濾膜法：該法主要用于生活飲用水細菌數的測定，一般用硝酸纖維制成濾膜，量取500ml水從濾膜上過濾，過濾后的濾膜培養一定的時間（24～48h）后取出，計算濾膜上的菌落數，根據菌落數即可計算出每毫升液體的菌體數。

三、測量微生物生長的方法

1、測定細胞物質增長的方法

①干重法：取一定容量的培養物，用離心或過濾的方法，將菌體從培養基中分離出來，洗凈烘干、稱重，求出培養物中的菌體質量，作為生長量的指標。霉菌生長量的測定常用此法。

②含氮量測定法：此法只適用于細胞濃度較高的樣品，由于操作過程也較麻煩，故主要用于科學研究。

③比濁法：這是測定菌懸液中細胞數的快速方法。其原理是菌懸液中細胞濃度與混濁度成正比，與透光度成反比。此法簡便，但使用時須注意樣品顏色不宜太深，樣品中不要混雜其他物質，同時菌懸液濃度必須在107個/ml以上才能顯示可信的混濁度。

一、微生物的酶

酶是由活的微生物體產生的、具有特殊催化能力的蛋白質。它能在常溫、常壓下促進微生物體內一系列的分解代謝與合成代謝的各種反應。

二、微生物的能量代謝

微生物所需能量的來源和外界的能源物質如何變成微生物可利用的形式，以及如何被微生物利用等，都是微生物能量代謝的基本問題。

1、ATP的生成：ATP是腺嘌呤核苷三磷酸（腺三磷）的縮寫，是生物體中zui重要的高能磷酸化合物，通常以A—P～P—P表示。“A”為腺嘌呤，“P”為磷酸根，“～”代表高能鍵。

但ATP的生成過程需要供應能量，能量來自光能或者化學能，以光能生成ATP的過程稱為光能磷酸化作用，以化學能生產ATP的過程稱為氧化磷酸化作用。

微生物的氧化作用可根據zui終電子受體的性質，分為有氧呼吸作用、無氧呼吸作用和發酵作用三種。

上述三種生物氧化的方式，獲得能量的水平不同，如以葡萄糖作為氧化的底物時，它們放出能量的反應見下表：

不同氧化方式的放能反應

氧化過程中所釋放出的大部分能量，只有通過磷酸化作用轉移至ATP中，才能成為生物可利用的能量。

2、微生物的呼吸類型：根據微生物與分子態氧的關系，即微生物在生活中是否需要氧，可將微生物分為以下幾個類型。

1）好氧性微生物：凡是生活中需要氧的微生物稱為好氧性微生物或好氣性微生物。大多數是細菌、所有的放線菌和霉菌都屬于此類型。在自然界中，好氧性微生物的種類和數量都是zui多的。

2）微好氧性微生物：只需要在微量氧的條件下生活的微生物稱為微好氧性微生物，如固氮螺菌。

3）厭氧性微生物：凡生活中不需要氧的微生物稱為厭氧性微生物。某些細菌，如某些梭狀芽孢桿菌。

4）兼性厭氧性微生物：凡在有氧或無氧的條件下都能生活的微生物稱為兼性厭氧性微生物。它們可在有氧或無氧的情況下以不同的氧化方式產生能量，有兩種類型：

①在有氧的條件下進行有氧呼吸，在無氧的條件下進行無氧呼吸。如反硝化細菌，在有氧時，以氧作為zui終電子受體進行有氧呼吸，在無氧時，以無機物NO₃－中的氧作為電子受體進行無氧呼吸。

②在有氧的條件下進行有氧呼吸作用，在無氧的條件下進行發酵作用，如酵母菌，在有氧時進行有氧呼吸，產生CO₂和H₂O，基質被*氧化，釋放較多能量，而在無氧條件下則進行發酵作用，產生CO₂和C₂H₅OH，即酒精發酵。

3、微生物的物質代謝及其產物

蛋白質的代謝：蛋白質是微生物的有機氮源。但大部分微生物不能利用純粹的蛋白質，因為蛋白質不能透過細胞膜。必須由胞外酶把它分解成簡單的產物，如Aa等，然后才能被微生物吸收而利用來構成菌體本身的成分。細菌分解蛋白質的能力如液化明膠和酪蛋白的胨化等，可用于鑒別細菌。此外，有些細菌在分解Aa時，還可以產生一些特殊的產物，根據這些產物可以用作細菌的鑒別。例如，大腸桿菌可以分解色氨酸產生吲哚。有些細菌如變形桿菌能分解胱氨酸等氨基酸而產生H₂S。通常在培養基中加入醋酸鉛，H₂S遇醋酸鉛，變成棕黃色或黑色的硫化鉛。這種方法也常用來作微生物分解Aa的生理生化鑒定。

糖的代謝：糖的種類很多，多數糖能被微生物利用。而微生物能否利用某些糖類，主要決定于微生物所具有的酶系統的性質。糖在有充分氧的環境中，被微生物利用時一般可以*分解為CO₂和H₂O，而無中間產物的積累。糖在缺氧的條件下被微生物利用時，可形成多種不*的代謝產物如C₂H₅OH、乳酸等。無論是在有氧或缺氧的條件下，微生物利用糖類所產生的代謝產物是多種多樣的。因此，可根據不同微生物在一定條件下進行糖代謝過程中所具有的代謝產物的特點，來鑒別微生物。

脂類代謝：雖然微生物也能利用脂類，但從量上來看，脂類不是微生物的主要養料。有些細菌能分泌脂肪酶，可以把脂肪分解為甘油及脂肪酸。甘油的分解代謝按照糖的代謝方式進行。而脂肪酸則是通過β氧化作用進入三羧酸循環的過程進行分解，zui終被分解為CO₂和H₂O

4、微生物的特殊代謝產物

①毒素：微生物在物質代謝過程中，能產生對人或動物有毒害的物質，稱為毒素。微生物所產生的毒素可分為內毒素和外毒素兩大類。

內毒素存在于細菌體內，不分泌到菌體外，只能在菌體裂解時，毒素才能被釋放出來。

外毒素是由菌體內向菌體外分泌出來的一種有毒物質，毒力較強。

②抗菌素：有些微生物在代謝過程中可產生具有抑制或殺死它種微生物的物質，這種物質稱為抗菌素，例如點青霉和產黃青霉產生青霉素。

一、原理

大多數微生物均可用人工方法培養。以人工方法配制成的適合微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養基質，稱為培養基，培養基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機鹽、生長素以及水分等。另外，培養基還應具有適宜的ph值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。

二、培養基的種類

培養基按物理狀態分為固體、半固體和液體培養基；按組成成分分為天然、合成和半合成培養基；按其作用分為基礎、加富、選擇、鑒別、厭氧和活體培養基等。

1、基礎培養基：含有微生物所需要的基本營養成分，如肉湯培養基。

2、加富培養基：在基礎培養基中再加入葡萄糖。血液、血清或酵母浸膏等物質，可供營養要求較高的微生物生長，如血平板、血清肉湯等。

3、活體培養基：有一些微生物可以在活的動植物體或離體的活組織細胞內生長繁殖，因此，某些活的動植物體或離體的活組織細胞對這些微生物來說，是很好的培養基。

4、選擇培養基：是根據某一種或某一類微生物的特殊營養要求或對一些物理?；瘜W條件的抗性而設計的培養基。利用這種培養基可以把所需要的微生物從混雜的其他微生物中分離出來。

5、鑒別培養基：在培養基中加入某種試劑或化學藥品，使培養后發生某種化學變化，從而鑒別不同類型的微生物。如伊紅－美藍（EMB）培養基、糖發酵管、醋酸鉛培養基等。

6、厭氧培養基：專性厭氧菌不能在有氧的條件下生長，所以必須將培養基與環境中的空氣隔絕，或降低培養基中的氧化還原電位，如在液體培養基的表面加蓋凡士林或醋，或在液體培養基中加入碎肉快制成庖肉培養基等。此外，也可以利用物理或化學的方法除去培養環境中的氧，以保證厭氧環境。

三、培養基的制備

培養基的制備過程可表示為：

稱量藥品→溶解→調節PH值→溶化瓊脂→過濾分裝→包扎標記→滅菌→擺斜面或倒平板。

1、稱量藥品;根據培養基配方依次準確稱取各種藥品，放入適當大小的燒杯中，瓊脂不要加入。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。

2、溶解：用量筒取一定量（約占總量的1/2）蒸餾水倒入盛有藥品的燒杯中，在放有石棉網的電爐上小火加熱，并用玻璃棒攪拌，以防液體溢出。待各種藥品*溶解后，停止加熱，補足水分。如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其他原料，待*溶化后，補足水分。

3、調節PH值：根據培養基對PH值的要求，用50g/LNaOH或5%（體積分數）HCl溶液調至所需的PH值。測定PH值可用PH試紙或酸度計等。

4、溶化瓊脂：固體或半固體培養基須加入一定量的瓊脂，將盛有培養基的器皿置于電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂*溶化后才能停止攪拌，并補足水分（水需預熱）。注意控制火力不要使培養基溢出或燒焦。

5、過濾分裝：先將過濾分裝裝置安裝好。如果是液體培養基，玻璃漏斗中放一層濾紙；如果是固體或半固體培養基，則須在漏斗中放多層紗布，或兩層紗布夾一層薄薄的脫脂棉趁熱進行過濾。過濾后立即進行分裝。分裝時注意不要使培養基沾染在瓶口或管口，以免浸濕棉塞，引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝量為管高的1/5，半固體分裝量一般以試管高度的1/3為宜，分裝三角瓶，以不超過三角瓶容積的一半為宜。

6、包扎標記：培養基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。在包裝紙上標明培養基名稱、制備組別和實驗者姓名、日期等。

7、滅菌：上述培養基應按培養基配方中規定的條件及時進行滅菌。普通培養基為121℃，20min，以保證滅菌效果和不損傷培養基的有效成分。如需要作斜面固體培養基，則滅菌后立即擺放成斜面。斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜；半固體培養基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。

四、培養基的主要成分

1、營養物質：有蛋白胨、肉浸汁和牛肉-膏、糖（醇）類、血液、雞蛋與動物血清、生長因子、無機鹽類。

2、水分：制備培養基常用蒸餾水（因蒸餾水中不含雜質），也可用自來水、井水等，但需先經煮沸，使部分鹽類沉淀，再經過濾方可使用。

3、凝固物質：配制固體培養基的凝固物質有瓊脂、明膠和卵白蛋白及血清等。瓊脂是從石花菜海藻中提取的膠體物質，是應用zui-廣的凝固劑。其化學成分主要是多糖，加瓊脂制成的培養基在98～100℃下溶化，于45℃以下凝固。但多次反復溶化，其凝固性降低。瓊脂本身對細菌無營養價值，自然界中僅有極少數的細菌能分解它。

根據瓊脂含量的多少，可配制成不同性狀的培養基。另外，由于各種牌號瓊脂的凝固能力不同，以及當時氣溫的不同，配制時用量應酌情增減，夏季可適當多加。

4、抑制劑：在制備某些培養基時需加入一定的抑制劑，來抑制非檢出菌的生長或使其少生長，以利于檢出菌的生長。抑制劑種類很多，常用的有膽鹽、煌綠、玫瑰紅酸、亞硫酸鈉、某些染料及抗菌素等。這些物質具有選擇性抗菌作用。

5、指示劑：為便于了解和觀察細菌是否利用和分解糖類等物質，常在某些培養基中加入一定種類的指示劑，如酸堿指示劑、氧化還原指示劑等。