微生物無菌操作

常用的滅菌方法

1、加熱滅菌：加熱滅菌是通過加熱高溫使菌體內蛋白質變性凝固，酶失活，從而達到殺菌的目的。蛋白質的凝固變性與其自身含水量有關，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。

加熱滅菌法包括濕熱滅菌和干熱滅菌兩種。在同一溫度下，濕熱的滅菌效力比干熱大，濕熱的穿透力比干熱強，可增加滅菌的效力；濕熱的蒸汽有潛熱存在，這種潛熱能迅速提高被滅菌物體的溫度。

1）濕熱滅菌法：常用的濕熱滅菌法有巴氏消毒法、煮沸消毒法、流通蒸汽消毒法及高壓蒸汽滅菌法。

①巴氏消毒法:某些物質在高溫下易被破壞、巴斯德首先提倡把液體物質在較低的溫度下進行消毒，這樣即可殺死液體中致病菌的繁殖體，又不破壞液體物質中原有的營養成分。牛奶或酒類常用此法消毒。典型的溫度時間的組合有兩種：一種是61.1～62.8℃，30min；另一種是72℃，15～30min，現多用后一種。

②煮沸消毒法：此方法適用于器材、器皿、衣物及小型日用物品的消毒。

③間歇滅菌法：此方法適用于不宜高溫滅菌的物質，如不耐熱的藥品、含血清的培養基等。

為了消滅其中的芽孢，須用間歇滅菌法。方法是用阿諾氏滅菌器、水浴鍋或蒸籠加熱約100℃持續30min，每日進行一次，連續兩天。為了達到*滅菌，照上法再進行第三次加熱，這樣所有的芽孢將被全部殺死。必要時，加熱溫度可低于100℃（如75～95℃），而延長每次加熱的時間至30～60min，或增加加熱次數，也可收到同樣的效果。

④高壓蒸汽滅菌法：高壓蒸汽滅菌是微生物試驗中zui常用的滅菌方法。這種滅菌方法是利用水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理。當蒸汽壓力達到103.4kpa時，水蒸氣的溫度升高到121℃，經15～20min，可全部殺死鍋內物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。此法適用于耐高溫而又不怕蒸汽的物品的滅菌，一般培養基和敷料、生理鹽水、耐熱藥品、金屬器材、玻璃儀器以及傳染性標本和工作服等都可應用此法滅菌。

2）干熱滅菌法：通過使用干熱空氣殺滅微生物的方法叫干熱滅菌法。一般是把待滅菌的物品包裝好后，放入干燥箱中加熱至160℃，維持2h。常用于空玻璃儀器、金屬器具的滅菌。凡帶有橡膠的物品、液體及固體培養基等都不能用此法進行滅菌。

①干燥箱滅菌：將包扎好的物品放入干燥箱內，注意不要擺放太密，以免妨礙空氣流通；不得使器皿與烘箱的內層底板直接接觸。將烘箱的溫度升至160℃并恒溫2h，注意勿使溫度過高，若超過170℃，器皿外包裹的紙張、棉花會被燒焦燃燒。如果是為了烘干玻璃儀器，溫度為120℃持續30min即可。溫度降至50～60℃時方可打開箱門，取出物品，否則玻璃儀器會因驟冷而爆裂。另外，被污染的紙張、試驗用動物尸體等無經濟價值的物品可以通過火焚燒掉；對于接種環、接種針或其他金屬用具等耐燃物品，可用火焰灼燒滅菌法直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進行滅菌；直接用火焰灼燒滅菌，迅速*。此外，在接種的過程中，試管或三角瓶口，也采用灼燒滅菌法通過火焰灼燒而達到滅菌的目的。

②滅菌前的準備：玻璃儀器等在滅菌前必須經正確包裹和加塞，以保證玻璃儀器滅菌后不被外界雜菌所污染。常用玻璃儀器包裝和加塞的方法：平皿用紙包扎或裝在金屬平皿筒內，三角瓶在棉塞與瓶口外再包以厚紙，用棉繩以活結扎緊，以防滅菌后瓶口被外界雜菌所污染；吸管用拉直的曲別針將棉花輕輕的捅入管口，松緊必須適中，管口外露的棉花可統一通過火焰燒去，滅菌時將吸管裝入金屬筒內進行滅菌，也可用紙條斜著從吸管尖-端包起，逐步向上卷，頭端的紙條捏扁并擰幾下，再將包好的吸管集中滅菌。

2、過濾除菌法：凡不能耐受高溫或化學藥物滅菌的藥液、毒素、血液等。可使用過濾除菌法除菌。

3、紫外線殺菌法：日光中殺菌的主要成分是紫外線。紫外線波長200～300nm，具有殺菌作用，其中以253.7nmzui強，這與DNA的吸收光譜范圍一致。紫外線的穿透力不強，普通玻璃、塵埃、水蒸氣均能阻擋紫外線，故只能用于手術室、無菌室等空氣消毒，也可用于不耐熱物品或包裝材料的表面消毒。在消毒照射時，工作人員應佩戴保護眼睛，以防紫外線損害角膜而引起急性角膜炎。

微生物的接種和培養

將微生物的純種或含有微生物的材料（如水、食品、空氣、土壤、排泄物等）轉移到培養基上的過程叫微生物接種。經微生物接種后的培養基被放置在一定環境條件下，使微生物在培養基上生長繁殖，這一過程叫做微生物的培養。

1、微生物的培養

人工培養微生物的過程中，除了供給一定的營養物質外，還必須提供微生物生長繁殖的條件，但因不同種類的微生物需要的條件不*相同，所以就有需氧培養、厭氧培養等不同的方式。

①需氧培養：對需氧微生物的培養必須在有氧的環境中進行，在實驗中，液體或固體培養基經接種微生物后，一般將其置于保溫箱中在有氧的條件下培養。有時為了加速繁殖的速度或進行大量的液體培養時，可用通氣攪拌或振蕩的方法來充分供氧，但通入的空氣必須經過凈化或無菌處理。

②厭氧培養：培養厭氧性微生物時，要除去培養基中的氧或使氧化還原點位降低，并在培養過程中一直保持與外界氧隔絕以使厭氧微生物生長。在培養中保持無氧環境的方法有物理法除氧、化學法除氧和生物法除氧。

2、微生物的接種方法

浸洗法：用接種針挑取接種材料后，即插入液體培養基中，將菌洗入培養基內。有時也可將某些固形含菌材料直接浸入培養液中，把附著在表面的菌體洗下。

活體接種：活體接種應用于病毒培養，因為病毒必須接種在生活的組織細胞中才能生長繁殖。如果要分離某些病原微生物或檢查某些病原微生物的致病特性以及毒力測定時，一般用活的動物進行接種。

涂布法：將純菌或含菌材料（包括固形物或液體）均勻地分布在固體培養基表面，或者將含菌材料在固體培養基的表面僅作局部涂布，然后再用劃線法使它分散在整個培養基的表面。

傾注法：取少許純菌或少許純菌材料（一般是液體材料），先放入液體的培養皿中，而后傾入已溶化并冷卻至46℃左右含有瓊脂的滅菌培養基上，使它與含菌材料均勻混合后，冷卻使其凝固。

點植法：將純菌或含菌材料用接種針在固體培養基表面的幾個點接觸一下。點植法常用于霉菌的接種。

穿刺法：用接種針將微生物純種經穿刺而進入到培養基中去。穿刺法常應用于半固體深層培養基，通過穿刺進行培養，可以有助于探知這種菌種對氧的需要情況以及有無動力產生。

劃線法：將純菌或含菌材料用微生物接種法在固體培養基表面進行劃線，使微生物細胞能分散在培養基的表面，并使接種量在培養基表面起著稀釋作用，即在培養基的單位面積內的接種量從多量逐漸依次減少為少量。劃線法是進行微生物分離時的一種常規接種法。

影響滅菌與消毒的因素

1、微生物的特性：不同的微生物對熱的抵抗力和對消毒劑的敏感性不同，細菌、酵母菌的營養體、霉菌的菌絲體對熱較敏感，放線菌、酵母、霉菌的孢子比營養細胞抗熱性強。不同菌齡的細胞，其抗熱性、抗毒力也不同，在同一溫度下，對數生的菌體細胞抗熱力、抗毒力較小，穩定期的老齡細胞抗性較大。

2、酸堿度：大多數的微生物在酸性或堿性溶液中，比在中性溶液中容易被殺死。

3、介質：微生物所依附的介質對滅菌效果的影響較大。介質成分越復雜，滅菌所需的強度越大。

4、微生物污染程度：待滅菌的物品中含菌數較多時，滅菌越是困難，滅菌所需要的時間和強度均應增加。這是因為微生物群集在一起，加強了機械保護作用，而且抗性強的個體增多，也增加了滅菌的難度。

5、溫度：溫度越高，滅菌效果越好。菌液被冰凍時，滅菌效果則顯著降低。

6、穿透條件：殺菌因子只有同微生物細胞相接觸，才可以發揮作用。在滅菌時，必須創造穿透條件，保證殺菌因子的穿透，滅菌時所需時間應比液體培養基長；濕熱蒸汽的穿透能力比干熱蒸汽強；環氧己烷的穿透能力比甲醛強。

7、滅菌處理劑量：滅菌處理劑量是指處理強度和處理方法對微生物的作用時間。所謂強度，在加熱滅菌中指滅菌的溫度；在輻射滅菌中指輻射的劑量；在化學藥劑消毒中指的是藥物的濃度，一般來說，強度越高，作用時間越長，對微生物的影響越大，滅菌程度越*。

8、氧：氧的存在能加強電離輻射的殺菌作用。當有氧存在時，H可與氧產生有強氧化作用的H₂O和H₂O₂，與無氧照射時相比，殺菌作用要強2.5~4倍。

9、濕度：熏蒸消毒，噴灑干粉，噴霧都與空氣的相對濕度有關。相對濕度合適時，滅菌效果zui-好。此外，在干燥的環境中，微生物常被介質包裹而受到保護，使電離輻射的作用受到限制，這時必須加強滅菌所需的電離輻射劑量。