簡介分光光度法

一、基本原理

光線是高速運動的光子流，也是具有波長和頻率特征的電磁波。光子的能量與頻率成正比，與波長成反比。肉眼可見的光線稱為可見光。可見光只占電磁波譜的很窄部分(400nm到760nm)。不同波長的可見光具有不同的顏色。波長大于760nm的光線稱為紅外線。波長小于400nm的光線稱為紫外線。

當一束白光通過一杯有顏色的溶液時，具有一定波長的光線選擇性的被溶液所吸收。不同物質由于其分子結構不同，對不同波長光線的吸收能力不同，因此每種物質都具有其特異的吸收光譜。吸收光譜的測定可以用來鑒定各種不同的物質。例如核黃素之所以呈現黃色，是由于它僅吸收可見光中的藍光范圍，并測得其吸收峰在450nm（圖1-3）。在紫外光范圍它還有兩個吸收峰。它們分別是260nm和370nm。

分光光度法常被用來測定溶液中存在的光吸收物質的濃度。其理論依據是郎伯—比爾(Lambert-Beer)定律。

 （核黃素22mmol/L溶于0.1mol/L  磷酸鈉中，pH7.06，吸收杯厚1cm）

（一）郎伯定律(Lambert’s Laws)

一束單色光在通過一溶液時，由于溶液吸收一部分光能，使光的強度減弱。若溶液的濃度不變，則溶液的厚度愈大，光強度的減弱也愈顯著(圖1-4)

若I₀表示入射光強度，I表示光線通過溶液后的強度，L表示溶液的厚度。

得：InI=－αL＋C       當Ｉ=0時，I=I₀，所以C=InI₀    即  InI=－αL＋InI₀

K₁是一常數，受光線波長、溶液性質和溶液濃度影響。從上述公式可知，透過溶液后，光強度的減弱（I/I₀）與溶液厚度（L）呈指數函數關系。可見光強度的改變與溶液厚度并不呈簡單的正比關系。這一關系就是郎伯定律。

 （二）比爾定律(Beer’s Law)

當一束單色光通過一溶液時，若溶液的厚度不變，則溶液濃度愈高，光線強度減弱也愈顯著，與上定律相似。兩者的關系可以表示如下：

其中，C表示溶液的濃度。K₂是一常數，受光線波長、溶液性質和溶液厚度的影響。上述公式所表示的光強度與溶液濃度的關系稱為比爾定律。

雖然所有的溶液均符合郎伯定律，但并非所有的溶液都符合比爾定律。這是由于有些物質在不同濃度條件下其顏色可能發生改變，即在不同濃度條件下其吸收光的波長發生改變。常見的原因如下：

    1．有些有色物質在溶液中可能解離成相應的離子，離子的顏色與分子的顏色不同，造成對比爾定律的誤差。

2．有些物質在較高濃度狀態下可形成絡合物，絡合物使吸收光譜發生改變。例如：氯化鈷在稀溶液中呈玫瑰色，而在濃溶液中呈藍色。

CoCl₂ + CoCl₂→Co2+ (CoCl₄)2-

玫瑰色         藍色

3．氫離子濃度和電解質也可引起一些有色物質顏色的改變，這些改變也可能造成比爾定律的誤差。

（三）郎伯——比爾定律及其應用

一般將通過溶液后的光線強度（I）和入射光（Io）的比值稱為透光度(transmittance, T)，將-Log  用光密度(Optical density, O.D.或D)表示，以反映該溶液對光吸收的情況。有時也用吸光度(absorbance, A)表示。則它們之間的關系如下

其中，Ｅ為消光系數(Extinction coefficient), 表示物質對光線吸收的本領，其值因物質種類和光線波長而異。

從公式（1）可知對于相同物質和相同波長的單色光（消光系數不變）來說，溶液的光密度和溶液的濃度呈正比。

如果C₂為標準溶液的濃度，則可根據測得的光密度值，按公式（2）求得待測溶液的濃度。

實際工作中為簡便起見，常常不是每測一個待測樣品都做一個標準管，而是事先測定一系列不同濃度的標準管，然后以光密度對標準濃度作圖，得到標準曲線，測得待測物質的光密度后，便可從標準曲線上查到相應的濃度數值。

從公式（1）可知，若知道某待測物質的消光系數和溶液的厚度，也可以從光密度推算出待測溶液的濃度。消光系數的常用表示方法有二：

1．百分消光系數（E1%_1cm）；濃度以百分濃度來表示的消光系數。百分消光系數等于濃度為1%，液層厚度為1cm的光密度值。

2．克分子消光系數（ε）；濃度以摩爾濃度來表示的消光系數。克分子消光系數等于溶液濃度為1個摩爾濃度，液層厚度為1cm的光密度值。

用消光系數計算濃度的公式是： 

例：一蛋白質溶液在其吸收峰λ=278nm處的光密度D=0.520，吸收杯厚度為1.00cm，已知E1%_1cm278=5.10，則此蛋白質溶液的濃度為 

 二、

幾種常用的國產分光光度計

（一）721型分光光度計（圖1-7）   

這是一種采用光電管為受光器的較高級可見光分光光度計。由穩壓電源供電的光源燈發出穩定的白光。如圖1-7所示。光線經反射鏡投入狹縫，再經準直鏡反射進入棱鏡，在棱鏡中發生色散后，光線經鋁面反射后，其中一部分經原路返回，并穿過狹縫，透過反射鏡進入吸收杯。從吸收杯射出的光線再經光門射到光電管上，產生相應的電流，并經電流表指示出相應的刻度值。

其中色散棱鏡裝在一個可以轉動的圓盤上，旋轉波長選擇鈕可使之發生偏轉，使不同波長的光線通過狹縫形成一定波長的單色平行光線。同時，波長盤也隨之轉動以指示波長數字。此型分光光度計給出360~800nm范圍的波長，在410-710nm之間靈敏、適用。使用方法如下（各調節部位參看圖1-8）。

1．靈敏度選擇鈕放在“1”檔（如調不到“0”時，再選用較高的檔）。

2．轉動波長選擇鈕，選用所需的波長。

3．接通電源（指示燈亮）。

4．揭開比色皿暗箱蓋，轉動“0”位鈕，使電表指針對準T=0處。

5．將比色杯杯放入比色杯架上，使空白管對向光路，蓋好比色皿暗箱蓋，轉動“百位鈕”調準電表指針使之指向D=0（T=100處）。

6． 拉動比色皿座的拉桿，使測定杯進入光路，迅速從電表上讀出光密度值，記錄。測讀過程中，隨時將拉桿推回到原位，使空白杯進入光路，并轉動“百位鈕”，使指針回到D=0處。

7． 比色完畢后，關上電源開關，取出比色杯，將比色皿暗箱蓋蓋好，清洗比色皿并空干。

8． 注意事項

（1）光電比色計屬精密儀器，應精心愛護使用，要防震、防潮、防腐蝕。

（2）比色杯的好壞對光密度讀數的影響很大，要保持比色杯的清潔干凈，保護光學面的透明度，不能手握光學面，也不能用粗糙的物體接觸光學面，比色杯中的液體應適量，不應過滿，比色杯外壁的液體應用擦鏡紙擦干，以防腐蝕儀器和影響讀數。如比色液為強酸強堿，應盡快比色，以防破壞比色杯。

（3）比色時間應盡量縮短，以防光電系統疲勞。如需連續使用，中間應適當暫停使用，使之避光休息。

（二）UV-754型分光光度計

這是一種可供在紫外到紅外區（200-1000nm）測量吸收光譜的較高級分光光度計。此儀器的光學部分與721型分光光度計相類似，但它采用石英棱鏡作單色光器，有鎢絲燈和氫弧燈兩種光源。754型分光光度計的電學部分較為復雜（圖1-9）。光電流經過放大線路加以放大后，此時得到的樣品信號變為與透光率成比例的值。其后，調零、變換對數、濃度計算、打印數據等均由微處理機進行。

儀器的使用方法

1．測試準備

（1）打開電源開關之前,檢查一下試樣室是否放置遮光物。

（2）試樣槽置“參考”位置。

（3）接電源開關(如果波長工作在于200～360時需按氘燈觸發按鈕)。(參見圖1-9)

顯示器顯示“754”后，數顯而易見：“100.0”，則表示儀器已通過自檢程序。

（4）儀器預熱三十分鐘后開始測試。

測試

（1）數顯為100.0后，穩定2～3秒鐘，即可把試樣槽置“樣品”位置進行測試。待第-一個數據打印完畢后，再可將試樣槽置第二個“樣品”位置測試。

（2）每當需要調換波長時，必須把試樣槽置“參考”位置，重新調滿度。

[注意]：如果在幅度設定測試波長時，需等待數分鐘后，才能工作，因這時光能量變化急劇，使光電管受光后響應緩慢，需一段光響應平衡時間。

三、

分光光度計的結構原理

不論光度計(Photometers)、比色計（Colorimenters）還是分光光度計(Spectrophoto- meters)，其基本結構原理都是相似的，都由光源、單色光器、狹縫、吸收杯和檢測器系統等部分組成（圖1-5）。

（一）光源

一個良好的光源要求具備發光強度高、光亮穩定、光譜范圍廣和使用壽命長等特點。幾乎所有的光度計都采用穩壓調控的鎢燈(tungsten lamp)。它適用于做340-900nm范圍的光源。更的分光光度計外加有穩壓調控的氫燈(hydrogen lamp)。它適用于做200 -360nm的紫外分光分析的光源。

（二）單色光器

分光光度法測定某一物質的光密度需要在某一特定波長下進行。單色光器的作用在于根據需要選擇一定波長范圍的單色光。在實際工作中欲選擇出單個某波長的光線是困難的。所謂單色光是指在此波長有zui大發射，而在相鄰較長和較短波長范圍內的發射能量較少而言。單色光的波長范圍愈窄，儀器的敏感度愈高，測量的結果愈可靠。

zui簡單的單色光器是光電比色計上所采用的濾光片（一定顏色的玻璃片）。由于通過光線的光譜范圍較寬，所以光電比色計的分辨效果較差，但對比色分析還是可以得到較為滿意的效果的。棱鏡(Prism)的衍射光柵(diffraction grating)是較好的單色光器。它們能在較寬光譜范圍內分離出相對單一波長的光線（圖1-6）。

（三）狹縫

通過單色光器的發射光的強度可能過強也可能過弱不利于進一步檢測。狹縫是由一對隔板在光通路上形成的狹縫。通過調節狹縫的大小來調節入射單色光強度并使入射光形成平行光線，以適應檢測器的需要。光電比色計的狹縫是固定的，而光度計和分光光度計的狹縫大小是可調的。

（四）吸收杯

吸收杯又叫樣品杯(Sample Cell)，是光度測量系統的重要部分之一。在可見光范圍內測量時選用光學玻璃吸收杯，在紫外線范圍內測量時要選用石英吸收杯。注意保護吸收杯的質量是取得好的分析結果的重要條件之一。不得用粗糙、堅硬物質接觸吸收杯，不能用手指握取吸收杯的光學面；用后要用水及時沖洗，不得殘留測定液，尤其是蛋白質和核酸溶液。

（五）檢測器系統

硒光電池、光電管或光電倍增管等光電元件常用來作為受光器，將通過吸收杯的光線（I）的能量轉變成電能。進一步再用適當的方法測量所產生的電流。

光電比色計用硒光電池為受光器。硒光電池的光敏感性低。它不能檢出強度非常弱的光線。并且，對波長在270nm以下和700nm以上的光波不敏感。

較精密的分光光度計都是采用真空光電管或光電倍增管作為受光器的，并采用放大裝置以提高敏感度。雖然光譜范圍狹窄的單色光的能量比范圍寬的弱很多，但這種有放大線路的靈敏檢測系統仍可能準確地檢測出來。